课堂引入

1、回顾基因工程的基本操作程序

2、用实例“大肠杆菌生产人的胰岛素”分析基因工程的基本操作程序

3、在“大肠杆菌生产人的胰岛素”实例中，如何获取人的胰岛素？为什么要构建人的胰岛素基因的表达载体？怎样将人胰岛素基因的表达载体导入到大肠杆菌内？含有人胰岛素基因的大肠杆菌就一定能够合成人的胰岛素吗？

……

这些都是接下来几节课将会讨论的问题。

1、从书本上找到

2、①获取人的胰岛素基因，②构建人的胰岛素基因的表达载体，③将人的胰岛素基因的表达载体导入到大肠杆菌细胞内，④大肠杆菌生产人的胰岛素

使用实例进行回顾基因工程的基本操作程序，使得这些基本操作程序不至于太过抽象。

通过一些设问，表明接下来课程的重点，并吸引学生的注意力。

目的基因的获取

1、如何获取人的胰岛素基因？

2、怎么直接从人体组织中提取人的胰岛素基因？

3、每一次获取人的胰岛素基因的时候都从人身上取一块组织，进行分离，这样的过程太复杂，能不能取出人的胰岛素基因后，将这基因保存起来，以后要用的时候可以更容易地获得目的基因呢？

4、我们将人的胰岛素基因取出来，保存到受体菌群内，这个受体菌群就是基因文库。

为什么保存到细菌内？

5、介绍基因组文库和cDNA文库的构建过程（指导阅读，并通过展示示意图进行讲解）

6、通过构建基因文库确实可以让我们获取目的基因的过程变得简单，但是从基因文库中获取目的基因还是比较复杂，有没有更简单的方法，能够让我们快速获得大量目的基因呢？

7、利用PCR技术，我们甚至可以从1个人体细胞中，取出DNA后，不用限制酶获取胰岛素基因，在PCR仪器里，就可以特异性地大量扩增胰岛素基因，非常方便，要说缺点，就是比较贵。

具体过程是怎样的呢？

8、引物到底是什么呢？

9、为什么PCR反应体系里要加入引物？（提示：与DNA聚合酶的作用特点有关）

10、为什么要加2种不同的引物？（提示：根据PCR反应原理图）

11、【展示整个PCR反应的前三次循环】可以发现PCR扩增的只是两个引物之间的DNA片段，并且每一个引物使用后，都变成新合成DNA单链的一部分。

12、dATP、dTTP、dCTP、dGTP是什么？有什么作用呢？（提示：讲解ATP的分子结构）

13、展示PCR反应体系的两个动画视频，并根据视频进行相关过程的讲解。

14、作PCR反应与细胞内DNA复制的对比分析（列表）

15、如果基因比较小、核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。

1、可以直接从人的组织中提取。

2、从人身上取一块组织，分散成细胞群，获取染色体，获得DNA，选择其中的2个DNA，根据胰岛素基因两端的序列将胰岛素基因切割下来……

3、构建基因文库

4、胰岛素基因随细菌的分裂不断地遗传给子代细菌；细菌结构简单且DNA含量少，更容易分离得到胰岛素基因

5、阅读课本上的生物技术资料卡，并认真听讲

6、PCR技术

简单了解PCR的基本过程

8、根据一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。根据图示，可以发现引物其实是一段与目的基因已知序列互补的核酸片段。

9、Taq酶（热稳定DNA聚合酶）只能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，加入引物，才能使得Taq酶从引物开始进行DNA互补链的合成。

10、DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连接到已有DNA片段的3’端。根据图示，只有设计两种引物，使之分别与目的基因的两端碱基互补配对，才能同时复制目的基因的两条链。

12、联想ATP，dATP应该是脱氧三磷酸腺苷。能够为DNA的合成提供能量，并且可以作为DNA合成的原料。

14、分析（填表）

引导学生将过程想像得复杂一些，从而得到“为什么要构建基因文库”的理由

深刻理解构建基因文科的意义

使基因文库的构建过程更加直观、易于理解

引入PCR技术

引起学生对PCR技术的兴趣

通过一个问题一个问题的解答，学生逐渐掌握PCR反应的原理和过程

利用的视频动画材料，以及对比分析，更容易让学生从动画中深刻理解PCR反应体系的原理和过程

基因表达载体的构建

1、获得目的基因之后，我们可以直接将目的基因导入到受体细胞吗？

2、所以我们要构建基因表达载体。目的是：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

这里有三个关键词：稳定存在、遗传、表达和发挥作用，分别生命意思？

3、所以，我们要构建一个怎样的基因表达载体，才能使之同时满足以上条件呢？我们看课本基因表达载体模式图。

我们来说一说基因表达载体上的各个结构分别具有哪些作用？

4、构建基因表达载体是基因工程的核心，需要进行严格的设计。比如，①启动子的选择；②标记基因的选择；③运载体的选择等等：

5、启动子与基因的选择性表达有关。如果要让目的基因在羊乳腺细胞中特异性表达，启动子就要选择羊乳腺蛋白基因的启动子；如果要让目的基因在水稻胚乳细胞中特异性表达，启动子就应该选择水稻胚乳细胞的启动子。

6、标记基因的作用，实际上形成对照：含有标记基因的细胞和不含标记基因的细胞，性状上产生差异，进而帮助我们筛选出含有目的基因的细胞。

一般来讲，受体细胞是微生物细胞时，我们选择抗生素抗性基因作为标记基因。

但如果受体细胞是动植物细胞时，由于抗生素对动植物细胞没什么效果，使用抗生素抗性基因并不能很好的将含目的基因的细胞筛选出来。这时，可以使用什么基因作为标记基因呢？

7、构建基因表达载体的目的是将目的基因导入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定、遗传和表达。只能用质粒作为载体吗？

因此，当质粒作为载体进行构建基因表达载体时，基本的结构如图所示；当病毒作为载体进行构建基因表达载体时，基因表达载体的结构可能是怎样的呢？

这种重组病毒应该具有侵染性，同时，不具备致病性，且能将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上。

8、所以说构建基因表达载体是基因工程的核心，需要进行严格的设计。

1、不能。单独的目的基因在受体细胞内可能被破坏，无法存活、遗传和表达。

2、“稳定存在”是讲单独的目的基因可能在受体细胞内会被破坏；

“遗传”是指目的基因能够在受体细胞内完成DNA复制过程，并随着受体细胞从亲代细胞遗传给子代细胞；

“表达和发挥作用”指目的基因在受体细胞内能够转录和翻译出相应的目的蛋白，并且目的蛋白表现出相应的功能。

3、看图，并说出各个结构的作用：

①复制原点保证基因表达载体能够在受体细胞内完成DNA复制，即“遗传”；

②启动子和终止子暴增目的基因在受体细胞内能够正常转录，即“表达和发挥作用”的一部分；

③抗生素抗性基因保证我们能够鉴别并筛选出含有目的基因的受体细胞；

④完整的重组质粒保证目的基因在受体细胞内“稳定存在”。

6、绿色荧光蛋白基因等。含有绿色荧光蛋白基因的受体细胞发出绿色荧光，从而筛选出含目的基因的受体细胞。

7、除了可以用质粒作为载体之外，还可以使用动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等。

很可能是用目的基因替换一段病毒的核酸，外面包裹着病毒的蛋白质外壳，从而构成重组病毒。

提出问题，引起学生注意。

让学生深刻理解为什么要构建基因表达载体。

解释基因表达载体模式图各个结构的功能作用，更深刻理解基因表达载体的内涵。

构建基因表达载体是基因工程的核心，但是为什么这么说呢？通常上新课的时候都没有相关的解释，学生糊里糊涂，只是记得这一步是“核心”。4567，通过这些介绍，帮助学生理解为什么基因工程的核心是基因表达载体的构建，为什么基因工程的概念里有一句“进行严格的设计”。

将目的基因导入受体细胞

1、构建得到基因表达载体之后，我们要将其导入受体细胞，并使目的基因在受体细胞内维持稳定和表达，这个过程叫做转化。

我们有哪些方法可以将目的基因导入受体细胞呢？

2、将目的基因导入植物细胞的方法常见的有三种，其中最常用的是农杆菌转化法。

我们来看图分析一下：

①获取农杆菌的Ti质粒和目的基因；

②将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，得到重组的Ti质粒；

③将重组Ti质粒导入农杆菌，筛选得到含重组Ti质粒的农杆菌；怎么筛选？

④用含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞，T-DNA上的目的基因随之转移到植物细胞的染色体DNA上，从而获得含有目的基因的植物细胞。

然后培养再生成植株。

⑤为什么我们要将目的基因插到T-DNA上？

3、农杆菌转化法适用于将目的基因导入双子叶植物、裸子植物时。若要将目的基因导入单子叶植物，我们可以用基因枪法。

我们可以利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达。

4、花粉管通道法是我国科学奖独创的一种方法。在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加含目的基因的DNA，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。

5、将目的基因导入动物细胞常用的方法叫显微注射技术。

通常，用于转基因的的动物受体细胞，我们用动物受精卵，为什么呢？

基本的操作程序是：

①获得基因表达载体；

②获得受精卵细胞；

③显微注射得到转基因的受精卵；

④培养得到转基因的早期胚胎；

⑤胚胎移植，继续培养得到转基因个体。

显微注射法，其实就是第③步，看图可以知道，图的左边是一个吸嘴，将受精卵吸住固定好，右边的针管内含有目的基因，然后直接注射，将目的基因的表达载体注射到受精卵内。整个操作非常细微细致，需要在纤维操作仪条件下进行。

6、常常需要将目的基因导入微生物细胞，以获得转基因产品。比如大肠杆菌。原核细胞有哪些特点呢？

通常采用的方法是Ca²⁺处理法：

①用Ca²⁺处理细胞，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态，处于这种状态的细胞称为感受态细胞。感受态细胞与正常细胞相比，什么不一样了呢？

②将重组表达载体DNA分子溶液与感受态细胞混合，一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。

会不会所有的感受态细胞都吸收了DNA分子呢？

7、同样，将目的基因导入受体细胞后，目的基因并不一定就能在受体细胞内维持稳定和表达。所以，我们要对在受体细胞内的目的基因进行检测和鉴定。

1、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca²⁺处理法等

③在重组Ti质粒上插入四环素抗性基因。筛选时，在培养基中加入四环素进行培养，含重组Ti质粒的农杆菌存活下来。

为了让目的基因随T-DNA转移到植物细胞的染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。

为了确保转基因子代个体每个细胞都有目的基因，以确保目的基因在我们所需要的细胞内得到表达。

6、

繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。

在Ca²⁺作用下，细胞膜通透性增大了。

不会。转化效率不可能达到100%。

承接到基因工程第三步基本程序

图示分析，讲解农杆菌转化法

简单介绍基因枪法

简单介绍花粉管通道法

对显微注射法进行解释，以加深印象。

从原理上理解Ca²⁺处理法的作用。

目的基因的检测和鉴定

1、目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。

2、首先，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。

①稳定遗传是什么意思？

②为什么说目的基因插入转基因生物的DNA上，才能确保其稳定遗传呢？

（联系有丝分裂进行回答）

③所用的方法是DNA分子杂交技术：提出转基因生物的基因组DNA，用基因探针进行检测，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。

什么是基因探针？

3、什么是杂交带？

杂交带实际上是杂交分子通过电泳技术显示出来的条带。

展示动画过程：

不同质量不同带电量的带电粒子在电场中的移动速率不同，从而用一定强度的电场区分出各种带电粒子，即电泳技术。

蛋白质和核酸都是带电分子，不同分子量的核酸，不同碱基组成的核酸，不同的蛋白质分子在电场中的移动速率各不相同。通过最后显示出来的条带，我们可以判断出该条带是否是杂交分子，从而检测出目的基因、目的基因转录出的mRNA、目的蛋白。

4、其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，怎么理解？

方法是分子杂交技术：提取转基因生物的mRNA，用基因探针进行检测，若显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。

5、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。

检测方法是，先用目的蛋白注射到免疫动物体内，获取相应抗体；再提取转基因生物中的蛋白质，进行抗原-抗体杂交检测，若出现杂交带，则表明目的基因已形成蛋白质产品。

在该方法中，注意，转基因生物体内提取的蛋白质是作为抗原。

6、即使转基因生物已经合成出相应的蛋白质，也不一定具有我们所需要的性状。能举出一些可能性吗？

所以，除了分子水平的检测与鉴定，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。

例如，抗虫棉。我们可以在转基因抗虫棉上接种一些棉铃虫，若棉铃虫难以生存，则转基因抗虫棉确实具有抗棉铃虫的特性。

此外，若是培育转基因抗病植株，就应该进行抗病接种实验，以确定转基因植株的抗病能力。

若是培育转基因耐旱植株呢，怎么检测？

2、

①亲代细胞有目的基因，当亲代细胞分裂得到子代细胞时，子代细胞一定有目的基因，就是目的基因稳定遗传给了子代。

②根据有丝分裂的规律，将DNA复制后，平均分配在两个子代细胞中。所以，当目的基因插入细胞核内的染色体DNA上时，经过有丝分裂得到的两个子代细胞，同样含有目的基因。

但如果目的基因在细胞质中，根据有丝分裂，细胞质内的物质是随机移向两极的。因此，子代细胞不一定有目的基因，所以不能稳定遗传。

放射性同位素标记的目的基因作为探针。

3、本质上是目的基因与基因探针经过碱基互补配对形成的杂交分子。

4、目的基因发挥功能作用，即目的基因表达出来相应的蛋白质，并执行某种功能，从而发挥作用。所以转录是第一步，第二步是翻译，翻译之后得到的蛋白质有可能发挥功能作用，也仍可能没有发挥功能作用。

6、比如转基因抗虫棉细胞内合成出了Bt毒蛋白，但是Bt毒蛋白可能会很快被分解，或者跟其他物质结合失去原有的功能等等，导致整个植株不一定表现出抗棉铃虫的特性。

应该讲转基因植株种植在干旱环境中吗，以确定转基因植株的耐旱能力。

通过层层递进的提问，解释为什么要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。

利用动画，详细直观地解释电泳技术得到的杂交带，让学生更好地理解DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术。

抗原-抗体杂交检测，通常都会比较绕，需要给与学生一定的时间，让学生自己理清之间的一些关系。

让学生理解为什么有时候要进行个体生物学水平上的检测。

举一些实例，说明个体生物学生的检测方法。

总结

通过基因工程这四个基本的操作程序，我们就获得了转基因生物。接下来，我们可以尝试一下，根据这四个基本的操作程序，在基因工程的应用这一节中，选取一个主题，将基因工程的过程描述清楚。这就是作业了。